NGS原理解析：二代测序流程
一、二代测序简介
1.第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）：又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。
2.一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序。
3.二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列。
4.现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。
5.由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，目前二代最长的读长是miseq的600bp。
6.二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。
鸟枪法：将大分子的目标DNA随机地处理成大小不同的小片段进行测序，并在后续的生物信息学分析中将这些短序列组装成目标DNA的技术方法。
传统方法：使用限制性内切酶对目标DNA上的限制性内切酶识别位点进行切割，从而形成小片段。
常用方法：使用机械法（例如超声波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定长度范围内分布的短序列片段。
二、代测序的背景和特点
1.2005年，罗氏推出了第一款二代测序仪罗氏454，生命科学开始进入高通量测序时代。
2.随着Illumina系列测序平台的推出，极大降低了二代测序的价格，推动了高通量测序在生命科学各个研究领域的普及。
3.特点：通量高、读长短
三、NGS实验步骤
1.核酸提取与检测
2.文库构建与文库检测
3.上机测序
原理：
从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。
去除蛋白的方法有3种：
①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA+与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
磁珠吸附法
过柱收集法
DNA提取步骤
✱细胞裂解
✱去除杂质
✱回收DNA
✱清洗溶解DNA
2.文库构建与文库检测
NGS文库构建：DNA片段加接头修饰
的过程。
以试剂盒NEBNext®Ultra™II DNA Library Prep Kit for Illumina®为例
具体步骤：
①末端修饰：
1.使用Tap聚合酶补齐不平的末端
2.并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Tap酶扩增，则无需末端修饰）
3.产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）
②添加接头：
1.经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。
2.NEB的接头为特殊的碱基U链接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成"Y"型接头。
3.上一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1 SP/Rd2 SP）.
4.之所以为"Y"型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错），连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出来的T与DNA链接，"Y"接头保证了每条单序列均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的管核苷酸序列（P5/P7）。
③磁珠纯化：
添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂志，从而获得成功添加接头的文库片段。
1.原理：磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面还有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。
2.注意事项：磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（实际上就是PEG添加量）来实现片段选择。
④PCR扩增：
1.添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。
2.片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。
⑤第二次磁珠纯化：
1.PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化。
2.之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。
总体流程
①
②
五、NGS上机测序
（一）成簇
成簇是DNA片段被扩增的过程，该过程在流动池 (Flowcell) 中完成。它是一片带有8条通道（lanes）的玻璃载玻，每个通道内表面附有两种DNA引物。
引物会与样品中的DNA片段的接头序列互补配对，固定在通道表面
通过聚合酶生成杂交片段的互补片段，然后加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链（左边的链）被流动池中的液体洗去
加入中性液体用于中和碱溶液，剩下的单链拷贝链另一端的接头就会与通道表面的引物结合，形成单链桥。
同样的，在聚合酶参与下，生成互补链，最终形成双链桥
通过变性，DNA分子线性化，变为两个单链拷贝
它们又分别与自己配对的引物结合
重复这个循环，同时形成数百万的簇。所有的DNA片段都会被克隆扩增。
桥式扩增后，反向链会被切断洗去，仅留下正向链。为防止特异性结合重新形成单链桥，3'端被封锁
（二）测序
在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成子链。但是dNTP存在 3'端叠氮基会阻碍子链延伸，这使得每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后， Flowcell 通入液体洗掉多余的dNTP和酶，使用显微镜的激光扫描特征荧光信号。
荧光发射波长与信号强度一起决定了碱基的读出，所有的DNA片段的一个碱基会被同时读取。在大规模并行的过程中，机器读取的图像类似下面这样
加入化学试剂将叠氮基团与荧光基团切除，然后 Flowcell 再通入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成一个碱基。不断重复这个过程，完成第一次读取。
首先要将模板链3'去保护，模板折叠，index片段引入
在聚合酶参与下形成双链桥
然后变性，恢复为单链。注意，这次是将正向链切除并洗去，只留下反向链
反向链以测序引物为起始，与正向链类似，经过多个循环后完成读取。
测序完成后会产生数百万个 reads，基于在样品准备时构建的 index 分类来自不同样本的序列。对于每个样品来说，具有相似延伸的碱基被聚在一起。正向和反向read配对生成连续序列。这些序列通过与参考基因组匹配后，实现完整序列的构建。
谢 谢
